Первый блин

   Не так давно мы предприняли попытку воспроизвести результаты диссертационного исследования промнестической активности фенотропила [1] и сравнить его с прототипом многих ноотропных препаратов – пирацетамом.
   Поделимся с вами результатами проведённых экспериментов.
   Влияние веществ на долговременную память крыс-самцов породы Вистар (массой 180-200 г) оценивали в тесте «Условный рефлекс пассивного избегания» [2, 3] (УРПИ), о котором мы ранее писали.
   Фенотропил и пирацетам водились перорально (через рот) в дозе 23 мг/кг и 14 мг/кг на 2 %-ном крахмальном клейстере соответственно за 60 минут и 240 минут до обучающей сессии. Как ранее установлено, через 60 и 240 минут после введения концентрация фенотропила и пирацетама в ткани мозга максимальна [4, 5].
   В тёмном отсеке установки крысы в ходе обучающей сессии получали три 1-секундных электроболевых стимула, разделённых промежутками в 1 секунду. Сила тока составила 1 мА.
   В тесте УРПИ определяют 2 основных параметра, на основании которых судят о влиянии веществ на память – латентный период захода животного в опасный отсек, т.е. время от момента посадки в светлый отсек до захода животного в тёмный отсек, и число переходов, т.е. число животных, которые перешли в опасный отсек [2, 3]. Чем дольше латентный период и чем меньше число переходов в проверочной сессии, тем лучше память животных, или, как говорят физиологии, животные дольше сохраняют памятный след.
   Всего было 2 больших экспериментальных группы. В одной из них сохранность памятного следа проверяли на 1 и 7 дни, а во второй – только на 7 день. Таким образом мы решили проверить, как наличие проверочной сессии на 1-ый день влияет на результаты проверочной сессии на 7-ой день.
   Мы ожидали воспроизведения результатов диссертационного исследования Ждановой Анны Витальевны, а именно: существенного увеличения латентного периода и уменьшения числа переходов в группе крыс, получавших фенотропил. Так, например, животные, получавшие фенотропил в исследовании Ждановой А.В., совсем не заходили в опасный отсек на 1 и 7 сутки. Среди животных, получавших плацебо, т.е. раствор крахмала, в опасный отсек через 1 сутки зашло 87,5 % особей.

АЖ1
 
АЖ2

   В нашем исследовании картина была такая

ФП1
 
ФП2

   Через сутки после обучающей сессии среди животных, получавших пирацетам или фенотропил, в опасный тёмный отсек установки не зашло от 50 до 70 % особей. Однако такое же низкое число переходов было зафиксировано и в группе животных, получавших плацебо! То есть об ударах током не забывали даже контрольные животные.
   Такая же качественная картина наблюдалась на 7 сутки исследования во всех экспериментальных группах. Статистическая обработка результатов с применением критерия хи-квадрат показала, что по числу переходов опытные группы не отличаются от контрольных.
   К сожалению, латентный период при сравнении с применением статистики Краскела-Уоллиса в опытных и контрольных группах также не отличался.
   Каким образом можно интерпретировать результаты полученного эксперимента?
   Если бы животные контрольной группы (плацебо) демонстрировали положительную динамику забывания условного рефлекса, что выражалось бы снижением числа переходов и уменьшением латентного периода на 7 сутки после тренировочной сессии, то можно было бы сказать, что испытуемые вещества не проявляют промнестического действия. Однако поскольку животные контрольной группы не забывают приобретённый УРПИ, вывода о влиянии исследуемых веществ на память мы сделать не можем.
   Приведём такое сравнение.
   Предположим, исследуется влияние лекарства на снижение смертности экспериментальных животных при каком-либо заболевании. Но если в группе животных, которым вводили плацебо, ни одно животное не погибло от заболевания, то вывода о влиянии лекарства на смертность сделать невозможно.
   Мы попробовали выяснить причины того, почему в нашем опыте животные плохо забывают об ударах тока с тем, чтобы в следующем эксперименте усилить забывание в контрольной группе животных.
   Чем сильнее негативный стимул, тем дольше он сохраняется в памяти. Сравните укус комара и травму в автомобильной аварии. Что будет помниться дольше?
   Во-первых, можно предположить, что сила использованного нами тока, т.е. 1 мА, слишком велика, и в следующем опыте её нужно будет снизить в 2 раза, до 0,5 мА, для того, чтобы животные скорее забывали о его ударах.
   Во-вторых, поведение животных при выполнении теста УРПИ сложнее, чем может показаться исходя из данного нами ранее описания теста.
   Грызуны связывают опасность перехода в тёмный отсек установки не только с ударами тока, но и с другими действиями, которые ему предшествуют, а именно – взятием на руки экспериментатором и помещением в установку для тестирования. Эти факторы также способствуют тому, чтобы животные не заходили в тёмный
отсек.
   К счастью, существуют методы, которые позволяют отсечь воздействие нецелевых стрессовых факторов на результат эксперимента. К ним относятся так называемые хендлинг и габитуация [6].
   Хендлинг (от англ. «hand» – рука) – это процедура приучения экспериментальных животных к экспериментатору, заключающаяся в том, что животных в одно и то же время на 2-3 минуты берут на руки. Хендлинг, как правило, повторяют несколько дней подряд перед тестированием.
   Габитуация, в отличие от хендлинга, предусматривает привыкание животного к экспериментальной установке. Габитуацию проводят, помещая подопытную особь в установку, которая не находится под током, на 5-10 минут для того, чтобы она могла изучить её и убедиться в безопасности нахождения в ней. Проводят габитуацию, как правило, 1-2 раза перед тестированием.
   Закономерен вопрос, почему же происходило забывания ударов тока подопытными животными в экспериментах Ждановой А.В.
   Однозначного ответа на этот вопрос получить нельзя. В диссертационной работе этой исследовательницы, текстом которой мы располагаем, не были описаны процедуры хендлинга и габитуации, но мы не можем сказать, действительно ли они не проводились.
   Есть ещё один нюанс. Норковый инстинкт, под воздействием которого грызун перебегает из светлого в тёмный отсек экспериментальной установки, связан с фотофобией, т.е. боязнью света. Если в опытах Ждановой уровень освещённости в светлом отсеке установки отличался от освещённости в отсеке установки, в которой исследовались наши животные, то это также могло сказаться на результатах.
   И, наконец, в-третьих. Несмотря на то, что в наших опытах и в опытах Ждановой были взяты крысы одной и той же породы, т.е. Вистар, они всё же могли отличаться. Животные каждой породы могут быть как аутбердными (в нашем случае), так и инбредными. Последнее означает, что они получены в результате близкородственного скрещивания на протяжении нескольких поколений. Близкородственное скрещивание может привести к тому, что однажды возникшая мутация, которая могла повлиять на нейрохимические процессы в мозгу, закрепляется в потомстве. В диссертационной работе Ждановой нет описания того, какие животные, аутбредные или инбредные, были взяты для опытов, но всякое отличие от наших животных могло сказаться на разнице в результатах.
   Итак, если подытожить.
   Для того, чтобы опыт по изучению УРПИ имел дифференцирующую силу, т.е. позволял отличать активные вещества от неактивных, следует снизить силу тока в тёмном отсеке экспериментальной установки, применить хендлинг и габитуацию, что позволит уменьшить стресс.
   Продолжение, надеемся, следует.

1.Жданова А.В. Психотропные и церебропротекторные свойства структурных аналогов N-карбомаил-метил-4-фенил-2-пирролидона (фенотропила): дис. … канд. мед. наук. Волг. гос. мед. университет, Волгоград, 2011.
2.Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. — М.: Гриф и К, 2012. C. 276-296.
3.Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения.— М.: Высш.шк., 1991. C. 175-190.
4.Антонова М.И. Экспериментальная фармакокинетика фенотропила: автореф. дис. … канд. хим. наук. Моск. гос. медико-стом. университет, Москва, 2005.
5.M.T. Tacconi, R.J. Wurtman. Physiological disposition of oral piracetam in Sprague-Dawley rats//J. Pharm. Pharmacol. 1984, vol. 36, No. 10, p.659-62.
6.R.M.J. Deacon Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments//Nature Protocols. 2006, vol. 1, No. 2, p. 936-946.

FINES Project учится

   C целью изучения передового опыта в области нейрофизиологических исследований, представитель нашей команды посетил Международную научно-практическую школу «От нейрона к мозгу: расширенный курс по нейрофизиологии», которая проходила в Казани с 28.09 по 04.10.2015 г на базе лаборатории нейробиологии Казанского (Приволжского) Федерального Университета.

лаборатория нейрофизиологии

   Мы смогли ознакомиться с оборудованием, применяемым для электрофизиологических исследований, и с некоторыми методиками, которые позволяют изучить работу мозга.
   Если вы помните, мы описывали работу по исследованию долговременной потенциации: приготовление срезов, установку микроэлектродов, запись и анализ электрической активности. Все эти этапы нейрофизиологической работы удалось увидеть вживую, а в части – принять непосредственное участие.
   Предлагаем вам фотоотчёт об участии в школе с краткими комментариями.
   Различают опыты in vitro (в пробирке) и in vivo (в живом организме). В первом случае необходимо провести забор клеток и/или тканей живого организма и переместить их в экспериментальную среду. Во втором случае экспериментальной средой является само животное.
   Очень часто в нейрофизиологических экспериментах используют срезы мозга, в частности – гиппокампа. Для изготовления
срезов используют специальное устройство – вибротом.

IMG_3699

Вибротом.

   Полученные срезы кондиционируют в растворе искусственной спиномозговой жидкости, которую необходимо насытить карбогеном – смесью кислорода и углекислого газа. Такая обработка позволяет сохранить клетки живыми.

IMG_3703

Кондиционирование срезов в растворе искусственной спиномозговой жидкости, через которую пропускают карбоген.

   После кондиционирования срезы переносят в электрофизиологическую установку, которая состоит из 2 функциональных блоков: оптического и электрического. Электрофизиологический микроскоп и камеры позволяют видеть участки ткани, подвергающиеся манипуляциям, а система микроэлектродов и электрических приборов осуществляет запись активности нервных клеток.

IMG_3705

Электрофизиологический микроскоп в клетке Фарадея.

   К другим важным частям электрофизиологической установки относят систему подачи перфузируемого раствора, в котором должен находиться срез мозга, блок управления микроэлектродами, а также стабилизаторы. Последние позволяют предотвратить перемещение тканей и клеток относительно электродов.

IMG_3866

Перистальтический насос для перфузии срезов.

   Всю электрофизиологическую установку помещают в металлическое ограждение, клетку Фарадея, которая существенно уменьшает помехи от электромагнитных полей.
   Исследования, которые нам удалось понаблюдать и в которых посчастливилось принять участие, можно разделить на 2 группы по числу нейронов, от которых, если пользоваться жаргонным языком, идёт запись: опыты с единственным нейроном и изучение сетевой активности, т.е. возбуждения большего числа нервных клеток.
   Одним из наиболее распространённых способов изучения активности одного нейрона является метод «patch-clamp», в котором рабочим электродом является специальная стеклянная пипетка, заполненная электролитом. Пипетка образует с мембраной клетки очень плотный контакт и позволяет как устанавливать мембранный потенциал (режим «voltage-clamp»), так и подавать в клетку нужный ток (режим «current-clamp»), а также проделывать кучу других вещей.

IMG_3868

Опыт patch-clamp в конфигурации cell-attached. Слева виден нейрон с присоединённой patch-пипеткой, справа – запись электрической активности (т.е. спайков) этого нейрона.

   На школе нам показали, каким образом метод «patch-clamp» позволяет изучать долговременную потенциацию. Схема эксперимента в данном случае аналогичной той, которую описывали мы. Разница заключается в том, что запись ведётся не от группы пирамидных клеток слоя СА1, а от одного нейрона. Картинка получается вот такая:

IMG_3862

Изучение долговременной потенциации с помощью метода «patch-clamp». После тетанизации токи, текущие через мембрану нейрона СА1, увеличиваются.

   Изучение сетевой активности проводят в условиях внеклеточной записи. В этом случае записывающий металлический электрод примыкает к изучаемой группе клеток, но столь плотный контакт, как в методе «patch-clamp», не нужен.
   В эксперименте по изучению сетевой активности мы пытались найти области соматосенсорной коры крысёнка, которые обрабатывают информацию, поступающую от того или иного уса (вибриссы). Для этого мы втыкали многоканальный электрод в мозг животного и раздражали вибриссу, которая, как мы предполагали, связана с участком мозга, в который этот электрод вводится. Попадание или непопадание определялось по отклику нейронов, фиксируемому многоканальным внеклеточным электродом.

IMG_3746

Пример записи нейронной активности с применением многоканального внеклеточного электрода. Записи в разных каналах обозначены разным цветом.

   Что дала школа нашему проекту?
   Будем банальны и повторим старую истину, немного переиначив её: «лучше один раз увидеть, чем сто раз прочитать». После школы мы стали гораздо лучше понимать, какое оборудование подходит для решения той или иной нейрофизиологической задачи, и теперь сможем увереннее планировать электрофизиологические эксперименты по изучению влияние ноотропных препаратов на активность клеток нервной системы.

Изучение ноотропных препаратов на улитках

   Мы давно ничего не публиковали, но это не значит, что FINES Project заглох. Наоборот, он получил некоторое идейное развитие, связанное с дальнейшими исследованиями в области фармакологии. Кроме того, мы занимались поиском новых возможных путей исследования ноотропных препаратов, об одном из которых хотим вам рассказать.
   В прошлый раз мы писали о том, что ноотропные препараты можно изучать на насекомых, в частности, на тараканах. Одним из недостатков работы с насекомыми является трудность введения точной дозы лекарственного препарата. В поисках иных объектов мы наткнулись на серию статей об изучении памяти на улитках-прудовиках и решили, что они могут быть подходящими и для FINES Project. В настоящее время наша команда обсуждает возможность сотрудничества в этой области с одним из специалистов по физиологии моллюсков.
   В основе изучения эффектов ноотропных препаратов лежит предположение о том, что они ускоряют выработку условных рефлексов (улучшают научение), а также способствуют тому, чтобы рефлексы (обретённые в ходе обучения навыки) воспроизводились как можно дольше, т.е. улучшают память. Каким же образом для изучения ноотропных препаратов можно использовать прудовиков?
   Прудовик – это улитка, которая живёт в водоёмах, но дышит атмосферным воздухом, периодически подымаясь для этого на поверхность и открывая пневмостом – отверстие, ведущее в легкое.

0875c5212c13

   Если улитку поместить в воду, в которой мало кислорода, то прудовик будет подниматься подышать чаще.
   Команда исследователей под руководством Кена Люковика (Ken Lukowiak) решила использовать число всплытий подышать как показатель обученности в следующем интересном эксперименте.
   Группу прудовиков помещали в воду без кислорода и за каждое всплытие подышать «наказывали» ударом карандаша по пневмостому. Такое обучение в бескислородной среде проводили несколько дней подряд. Оказывается, улитки способны связать всплытие подышать в бескислородной среде с ударом по пневмостому, поэтому учатся избегать удары, т.е. при помещении в бескислородную воду всплывают реже.

ca47fc09a4f6

Зависимость числа всплытий подышать пневмостомом (равное числу ударов в пневмостом) от порядкового номера обучающей сессии (А). Зависимость латентного периода всплытия подышать пневмостомом (т.е. время до первого всплытия) от порядкового номера обучающей сессии (Б). Тёмные кружки – опыт, светлые – контроль.

   На основе статей Люковика мы планируем свои эксперименты. Вкратце их суть будет заключаться в том, что во время формирования условного рефлекса, т.е. во время обучения, прудовики будут помещаться в раствор изучаемого соединения или же это соединение будет вводиться им в той или иной дозе. Сравнение эффективности разных веществ как ноотропов можно будет сделать по тому, как быстро будет выработан рефлекс, а также по времени его забывания. Чем быстрее будет вырабатываться рефлекс и чем медленнее он будет угасать, тем эффективнее изучаемое вещество как ноотроп. Хотим заметить, что если такой эксперимент будет поставлен, то мы будем первыми, кто изучил ноотропные препараты на улитках, так что пожелайте нам удачи!

FINES Project на Зимней школе

   Благодаря устроителям конкурса научных статей на сайте biomolecula.ru и благодаря тому, что вы активно поддерживали статью «Химические модификаторы памяти», написанную нашей командой, мы смогли представить свой проект на зимней школе для молодых учёных «Современная биология и биотехнология будущего 2015». Вот как это было:

как это было

   FINES Project вызвал у участников школы интерес, и мы надеемся на этой почве посотрудничать с научными группами из России и Украины, которые занимаются нейробиологией. Если такое сотрудничество состоится, то мы обязательно напишем о нём на нашем сайте.

Как изучают долговременную потенциацию на срезах гиппокампа/ How to Study Long-Term Potentiation in Hippocampal Slices (English version is below ↓)

   Расскажем ещё немного о том, каким образом можно выяснить механизм действия вещества на нервную систему. Напомним, что нам интересны ноотропные препараты, в частности, фенотропил, а также экспериментальные вещества, которые мы хотим синтезировать для проверки наших гипотез.
   Многие, если не большинство, эффектов лекарственных средств, действующих на нервную систему, реализуются через рецепторы. Рецептор – это большая (как правило, белковая) молекула, которая является частью клетки. Рецепторы могут находиться как на наружной поверхности клетки, так и в её цитоплазме, а также в ядре.
   Ранее мы писали о том, что основной принятой на сегодняшний день физиологической основой памяти является долговременная потенциация. С помощью электрофизиологических методов можно вызывать её в трисинаптической петле гиппокампа, что открывает широкие возможности изучения влияния различных веществ на память вне живого организма, т.е. на срезах мозга.
   Кратко описать подобные эксперименты можно следующим образом. Готовят тонкий срез гиппокампа, который помещают в раствор, поддерживающий жизнеспособность нервных клеток. В контрольном опыте нервные клетки среза стимулируют, чтобы вызывать долговременную потенциацию, и фиксируют полученный отклик. В раствор к другому срезу добавляют изучаемое вещество, вызывают долговременную потенциацию и сравнивают её временнЫе и электрические характеристики с параметрами отклика, полученного в контрольном опыте. По результатам можно сделать вывод о том, способствует ли изучаемое вещество развитию долговременной потенциации или оно её ослабляет.
   В раствор, омывающий гиппокамп, вместе с исследуемым веществом можно вводить блокаторы различных рецепторов и наблюдать за тем, как их присутствие меняет влияние изучаемого вещества на долговременную потенциацию. Если изменения происходят (т.е. вещество усиливает долговременную потенцивцию, а введение блокатора того или иного рецептора сводит эффект на нет), то может быть сделать вывод о том, что исследуемое вещество действует через заблокированный рецептор.
   А сейчас – подробнее.
   Как готовят срезы мозга, можно посмотреть тут и тут (беременным и слабонервным лучше по ссылкам не ходить).
   Важно, чтобы плоскость среза гиппокампа позволяла подвести электроды к компонентам трисинаптической петли. Для изучения долговременной потенциации используют два электрода, расположенных, как правило, внеклеточно. Часто первый, стимулирующий электрод, подводят к коллатералям Шаффера нейронов поля СА3, а второй, регистрирующий, помещают в stratum pyramidale (пирамидный слой) поля СА1, т.е. вблизи тел нейронов.

ДВП st.pyramidale

Расположение электродов при регистрации долговременной потенциации в st. pyramidale.

   В качестве “домашнего задания” можете попробовать придумать другое расположение электродов для изучения долговременной потенциации.
   Стимуляция коллатералей Шаффера через стимулирующий электрод вызывает ответ в телах пирамидных нейронов поля СА1. Этот ответ, фиксируемый регистрирующим электродом, называется “популяционный спайк“. Популяционный спайк отражает потенциал действия, который формируется в пирамидных клетках поля CA1. О возникновении долговременной потенциации можно судить по увеличению амплитуды популяционного спайка.

Амплитуда популяционного спайка

Популяционный спайк и его амплитуда.

   Особенностью долговременной потенциации является то, что её вызывает далеко на каждый стимул, посылаемый через возбуждающий электрод. Для её развития нужна тетанизация – серия быстрых разрядов частотой 100 Гц в течение нескольких секунд (хотя достаточно и 1 секунды).
   После того, как тетанизация вызвала долговременную потенциацию, отслеживают развитие последней во времени, посылая, например, каждые 30 секунд импульс на стимулирующий электрод и “снимая” регистрирующим электродом возникающие популяционные спайки. Обычно получают картину, похожую на приведённую ниже:

ltp4

“Картина” долговременной потенциации.

   На рисунке показана зависимость амплитуды популяционного спайка от времени до тетанизации (слева, область отрицательных времён) и после (справа, область положительных времён). После тетанизации наступает резкое увеличение амплитуды популяционного спайка, т.е. нейроны поля СA1 на каждый стимул, посылаемый со стороны нейронов поля CA3 через стимулирующий электрод, реагируют гораздо сильнее, что и есть проявление долговременной потенциации. Cерые и чёрные кружки обозначают разные условия эксперимента.
   Для любителей технических нюансов (надеемся, что среди наших читателей есть и такие) отметим, что изучать долговременную потенциацию можно и по-другому. Так, регистрирующий электрод можно разместить и в stratum radiatum (радиальный слой) поля СА1, т.е. среди дендритов пирамидных клеток.

регситрация в st.radiatum

Расположение электродов при регистрации долговременной потенциации в st. radiatum.

   В таком случае регистрирующий электрод будет фиксировать уже не популяционный спайк, а так называемый полевой возбуждающий постсинаптический потенциал (пВПСП), возникающий в дендритах. О развитии долговременной потенциации в таком случае судят обычно не по увеличению амплитуды пВПСП, а по увеличению наклона кривой, описывающей зависимость фиксируемого электродом потенциала от времени.

пВПСП

Полевой возбуждающий постсинаптический потенциал и его наклон.

   Мы для себя составили следующую схему, чтобы разбираться в статьях, написанных на тему изучения долговременной потенциации:

схема изучения ЛТП

* * *

   Let us explain a little more about how you can study a substance’s mechanism of action on a nervous system. As you probably remember, we are interested in nootropic drugs and in particular in Phenotropil, as well as in experimental substances we want to synthesize to test our hypotheses.
   Many, if not the majority of the effects, provided by drugs affecting nervous system, are imposed through receptors. Receptor is a large (usually proteinaceous) molecule that is part of the cell. Receptors may be situated on the outer cell surface, and in its cytoplasm, and in the nucleus.
   Earlier, we wrote that long-term potentiation is the main memory physiological basis adopted for today. It can be induced in hippocampal trisynaptic circuit using electrophysiological techniques. This fact opens the wide opportunities for studying different substances’ effects on memory in vitro, i.e. in brain slices.
   Such experiments can be briefly described as follows. A thin hippocampal slice is prepared, which is then placed in a solution supporting nerve cells viability. Nerve cells of the slice are then stimulated in a control experiment in order to induce long-term potentiation, and then a resulting response is recorded. Then a studied substance is added to another slice solution, and long-term potentiation there is induced in order to compare its time and electrical characteristics to the parameters of the response obtained in the control experiment. According to the results, we can then conclude, whether the studied substance promoted the development of a long-term potentiation, or decreases it.
   Various receptor blockers can be added in a hippocampal slice solution, together with the test substance, in order to observe how their presence changes the effect of the studied substance on a long-term potentiation. If the changes do occur (i.e. the substance does enhance long-term potentiation, and one or another receptor blocker adding reduces the effect to zero), then it can be concluded that the test substance acts through the blocked receptor.
   And now let’s get to the details.
   How brain slices are prepared, you can watch here and here
(pregnant and nervous should better not follow the links).
   It is important, that the hippocampal slice plane would allow attaching electrodes to the trisynaptic circuit elements. Two electrodes, usually located extracellularly, are used to study long-term potentiation. Often the first, stimulating electrode is applied to the Schaffer collaterals of the CA3 field neurons, and the second, the recording one, is placed in the stratum pyramidale of the CA1 field, i.e. near the neurons bodies.

ДВП st.pyramidale eng

Electrodes arrangement scheme for a long-term potentiation recording in st. pyramidale.

   As a kind of “homework” you can try to come up with a different electrodes arrangement scheme for a long-term potentiation study.
   Schaffer collaterals stimulation through the stimulating electrode causes a response in the CA1 field pyramidal neurons bodies. This response, recorded by a corresponding electrode, is called a “population spike.” Population spike reflects the action potential, which is formed in the CA1 field pyramidal cells. Long-term potentiation development can be assessed according to the increase in population spike amplitude.

Амплитуда популяционного спайка eng

Population spike and its amplitude.

   A long-term potentiation specificity is that it is induced far not by any stimulus sent through the exciting electrode. For it to be developed tetanization is needed — a series of fast discharges with 100 Hz frequency lasting for a few seconds (although usually even1 second is enough).
   After tetanization has induced long-term potentiation, the latter is tracked by the time of its development through sending an impulse to the stimulating electrode, for example, every 30 seconds and then ‘capturing’ the resulting population spikes with recording electrode. Usually a picture like the one below is obtained:

ltp4

Long-term potentiation ‘picture’.

   The figure shows the dependence of the population spike amplitude on the time period before tetanization (negative time periods area to the left) and after it (positive time periods area to the right). A sharp increase in the population spike amplitude occurs after tetanization, i.e. CA1 field neurons react much more strongly to each stimulus sent from the CA3 field neurons through the stimulating electrode, which is, in fact, the manifestation of a long-term potentiation. Gray and black circles represent the different experimental conditions.
   For technical nerds (we hope, there are some among our readers), we should note, that a long-term potentiation can be studied in a different way too. Thus, a recording electrode can be placed in the CA1 stratum radiatum, i.e. between pyramidal cells dendrites.

регситрация в st.radiatum eng

Electrodes arrangement scheme for a long-term potentiation (LTP) recording in st. pyramidale.

   In this case, the recording electrode will record not a population spike, but a so-called field excitatory postsynaptic potential (fEPP) emerging in the dendrites. A long-term potentiation development in this case is usually assessed not by an fEPP amplitude increase, but according to an increase of the curve slope describing the dependence of the potential recorded by the electrode, on time.

пВПСП eng

Field excitatory postsynaptic potential and its slope.

   We have made the following scheme for our own use to sort the articles written on the subject of a long-term potentiation study:

LTP1 eng

Не хлебом единым

   Поведенческие эксперименты для изучения памяти и научения проводят главным образом на грызунах – мышах и крысах. Однако при правильном подходе для этих целей можно использовать и низших, беспозвоночных животных.
   Ноотропные средства, как мы писали, обладают несколькими эффектами:
– промнестическим (улучшают память);
– улучшают обучаемость;
– адаптогенным.
   Последний эффект заключается в том, что ноотропы нормализуют деятельность центральной нервной системы при неблагоприятных условиях, например, гипоксии, голодании, стрессе и т.д.
   Изначально нас интересовали первые 2 составляющих ноотропного эффекта. Однако логично предположить, что если вещество обладает адаптогенным эффектом, то оно может обладать и первыми двумя. Таким образом, для выявления ноотропной активности можно тестировать изучаемые вещества на наличие адаптогенного эффекта.
   Одним из старейших поведенческих тестов для определения уровня тревожности грызунов является тест «открытое поле» (ОП). Его применяют для поиска анксиолитических препаратов, или транквилизаторов. Суть теста ОП заключается в том, что грызуна помещают на открытое, ограждённое стенкой пространство, называемое ареной, и фиксируют его локомоторную, или двигательную, активность.

http://www.openscience.ru/videofiles/01_open_field_1.avi

   Тревожность грызунов, вызванная боязнью открытых пространств, проявляется в этом тесте уменьшением вертикальных стоек, замиранием, избеганием центральной части арены, дефекацией, умыванием, понижением общей двигательной активности. Так как стресс является неблагоприятным фактором, то можно ожидать, что ноотропные препараты будет уменьшать проявления тревожности в ОП, что и было обнаружено во многих экспериментах.
   Поскольку исследования в ОП на грызунах дороги (это не означает, что мы отказываемся от тестов в УРПИ), мы предприняли литературный поиск и обнаружили, что в ОП тестировать вещества можно и на тараканах.

nauphoeta_cinerea_male1

Тропический пепельно-серый таракан.

   Их поведение в открытом после изучали при дневном освещении в течение 30 минут после чего дополнительно освещали арену лампой и наблюдали ещё в течение 10 минут.
   Поведение тараканов в ОП характеризуется 3 периодами различной двигательной активности. Сначала животные замирают, потом их двигательная активность резко возрастает, а потом уменьшается; последнее отражает привыкание к новой обстановке и адаптацию к стрессу. Дополнительное освещение вызывает новую волну замирания, а потом ускорения перемещения животных по арене. Так вот, установлено, что пирацетам статистически достоверно ускорял наступление успокоения, т.е. уменьшения перемещения тараканов по ОП. Уменьшение двигательной активности под действием пирацетама можно толковать как его адаптогенный эффект, проявляющийся в условиях стресса, вызванного боязнью открытых пространств и света.
   Уважаемые читатели! Если среди вас есть те, кто обладает возможностью проводить исследования на тараканах, то мы, команда FINES Project, приглашаем вас к сотрудничеству по тестированию экспериментальных веществ в ОП с последующим опубликованием полученных результатов.

Гиппокамп

   Эту статью мы хотим посвятить гиппокампу. Во-первых, потому что мы уже несколько раз его упоминали. Во-вторых, потому что один из планируемых нами экспериментов по изучению ноотропной активности подразумевает использование срезов этого мозгового образования. И чтобы понять суть этого эксперимента, надо иметь хотя бы небольшое представление о самом гиппокампе.
   Итак, гиппокамп. Это небольшое и очень древнее в эволюционном смысле образование, которое присутствует у всех позвоночных животных. И у всех позвоночных гиппокамп устроен по одному и тому же структурному плану.
   Гиппокамп представляет собой совокупность нервных клеток, последовательно соединённых своими длинными аксонами и расположенных послойно, что хорошо видно на его специальным образом окрашенных срезах.

гиппокамп мыши

Срез гиппокампа мыши.

   Эта особенность гиппокампа, т.е. чётко организованная ламинарная (слоистая) структура, привлекала нейробиологов очень давно, и во много благодаря ей гиппокамп стал одним из наиболее изученных образований мозга. Достаточно будет сказать, что первые рисунки микроизображений гиппокампа были выполнены знаменитым учёным, нобелевским лауреатом, итальянцем Камилло Гольджи ещё в конце 19 века.

гиппокамп Гольджи

Зарисовка структуры гиппокампа. Камилло Гольджи, 1984 год.

   Основная клеточная единица гиппокампа – пирамидная клетка, нейрон, названный так из-за пирамидальной формы своей сомы. Помимо пирамидных клеток, в гиппокампе в большом количестве представлены различные вставочные нейроны, регулирующие работу пирамидных клеток.
   В состав гиппокампа входит зубчатая извилина (dentate gyrus, DG), которая первой получает сигналы от нервных клеток коры и далее проводит их по трисинаптическому пути, организация которого будет рассмотрена ниже.
   Каким же образом нервный импульс может проходить по гиппокампу?
   Гиппокамп получает информацию из вне практически исключительно от энторинальной области коры (entorhinal cortex, EC). Соединение энторинальной области коры и зубчатой извилины образует перфорантный путь (perforant pathway). Нейрофизиологи обычно говорят, что перфорантный путь образован проекциями энторинальной коры на зубчатую извилину. Сначала по мшистым волокнам (mossy fibers), совокупности аксонов нервных клеток зубчатой извилины, нервный импульс поступает в поле гиппокампа СА 3, от него, по коллатералям Шаффера (Schaffer collaterals), аксонам пирамидных клеток поля СА 3, сигнал идёт в поле гиппокампа СА 1. Нейроны поля СА 1 дают проекции на энторинальную область коры, замыкая таким образом трисинаптический путь.

трисинаптическая петля
 The-Seat-of-Memory thumb

Трисинаптическая петля гиппокампа.

   Трисинаптическая петля – одна из самых ранних нейронных сетей, открытых в гиппокампе. В настоящее время установлено, что она представляет собой лишь часть проводящей системы гиппокампа. Она очень удобна для исследования влияния различных веществ на проведение нервного импульса. О том, как именно мы собираемся её использовать, расскажем в следующей статье.